Analyse der lagerungs- und strahlungsbedingten Veränderungen des zytosolischen Erythrozyten-Proteoms mittels zweidimensionaler differentieller Gelelektrophorese (2D DIGE) und Flüssigkeitschromatographie-hochauflösender Massenspektrometrie (LC-HRMS) - Walpurgis, K. (Deutsche Sporthochschule Köln, 2013)
Zusammenfassung Ziel dieser Arbeit war es, mittels 2D DIGE und LC-HRMS die durch ex vivo Lagerung und Gamma-Bestrahlung hervorgerufenen Veränderungen des zytosolischen Erythrozyten-Proteoms zu charakterisieren und spezifische Protein-Muster und potentielle Biomarker für erythrozytäre Lagerungs- und Strahlungsschäden zu identifizieren. Um eine Grundlage für die geplanten 2D DIGE Experimente zu schaffen, wurde zunächst auf Basis des kommerziell erhältlichen HemoVoidTM-Reagenz ein Aufarbeitungsprotokoll für die Präparation von hämoglobindepletierten Erythozyten-Lysaten entwickelt. Die ausgiebige Charakterisierung und Validierung dieser Methode zeigte, dass sie für die reproduzierbare Generierung zweidimensionaler Protein-Karten von Erythrozyten-Lysaten geeignet ist. Um die Anwendbarkeit des Protokolls zu demonstrieren, wurde exemplarisch eine zweidimensionale Referenzkarte des zytosolischen Erythrozyten-Proteoms zwischen pH 4 und 7 mit 100 analysierten Spots und 189 identifizierten Proteinen erstellt. Für die 2D DIGE-basierte Analyse der lagerungsbedingten Veränderungen des zytosolischen Erythrozyten-Proteoms wurden 12 leukozytendepletierte Erythozyten-Konzentrate unter Standard-Blutbankbedingungen für maximal 42 Tage bei 4 ± 2°C gelagert und zu festgelegten Zeitpunkten von 0, 7, 14, 28 und 42 Tagen mit Hilfe des zuvor entwickelten Protokolls aufgearbeitet. Die statistische Auswertung der 2D DIGE Gele ergab eine ansteigende Anzahl signifikant veränderter Spots mit zunehmender Lagerungsdauer. Nach 42 Tagen ex vivo Lagerung waren 25 Spots (davon 14 nach FDR-Korrektur) signifikant verändert (p ? 0,05) und aus den insgesamt 18 massenspektrometrisch identifizierten Proteinen (9 nach FDR-Korrektur) wurden die Transglutaminase 2, Beta Aktin und das Kupfer-Chaperon für die Superoxid Dismutase als potentielle Marker-Proteine für erythrozytäre Lagerungsschäden ausgewählt und mittels ein- und zweidimensionalem Western Blotting validiert. Um die Veränderungen des zytosolischen Erythrozyten-Proteoms durch Gamma-Bestrahlung und anschließende ex vivo Lagerung zu untersuchen, wurde ein zweites 2D DIGE Experiment mit 12 Erythozyten-Konzentraten durchgeführt, welche zur Inaktivierung verbliebener T-Lymphozyten den gängigen Empfehlungen des Europarates entsprechend mit 30 Gy bestrahlt und für 1 oder 15 Tage bei 4 ± 2°C gelagert wurden. Es zeigte sich, dass Gamma-Bestrahlung einen verstärkenden Effekt auf die Ausbildung von erythrozytären Lagerungsschäden hat. Nach 15 Tagen ex vivo Lagerung waren in den bestrahlten Erythrozyten-Konzentraten 27 Spots signifikant verändert und von den 13 darin identifizierten Proteinen wurden das DNA damage-binding protein 1, das Valosin-containing protein und erneut die Transglutaminase 2 als potentielle Biomarker für strahlungs- und lagerungsinduzierte erythrozytäre Schäden ausgewählt und validiert. Die Protein-Muster und Marker-Proteine, welche im Rahmen dieser Arbeit identifiziert wurden, erweitern nicht nur das Verständnis der bei der Herstellung und Lagerung von Erythrozyten-Konzentraten auftretenden strukturellen und funktionellen Veränderungen, sondern können gleichermaßen in der Transfusionsmedizin und der präventiven Dopingforschung genutzt werden, um beispielsweise die Qualitätsüberwachung von gelagerten Blutprodukten zu verbessern oder ein Nachweisverfahren für die Manipulation mit autologem Blutdoping zu entwickeln. Abstract The aim of the present thesis was to analyze the influence of ex vivo storage and pre-storage irradiation on the cytosolic red blood cell (RBC) proteome by means of 2D DIGE and high-resolution mass spectrometry and identify characteristic protein patterns and potential marker proteins for the assessment of storage- and irradiation-induced RBC lesions. At first, an alternative approach for the preparation of hemoglobin-depleted RBC lysates using the commercially available HemoVoidTM reagent was developed to provide a basis for the planned 2D DIGE experiments. The results of the method`s characterization and validation showed that the presented protocol is highly suitable to prepare reproducible 2D protein maps of RBC lysates. Thus, it was exemplary used to create a 2D reference map (pH 4-7) of the cytosolic RBC proteome comprising a total of 100 analyzed spots and 189 identified proteins. For the 2D DIGE-based analysis of the storage-induced changes of the cytosolic RBC proteome, a total of 12 leukodepleted RBC concentrates were stored according to standard blood bank conditions at 4 ± 2°C for a maximum length of 42 days and analyzed at defined intervals of 0, 7, 14, 28, and 42 days by using the previously validated sample preparation protocol. The statistical evaluation of the 2D DIGE gels yielded an increasing number of significantly altered spots with prolonged storage time. A total of 25 spots (14 following FDR-correction) were found to be significantly altered after the maximum storage period, and out of 18 identified proteins (9 following FDR-correction), transglutaminase 2, beta actin, and copper chaperone for superoxide dismutase were selected as potential marker proteins for RBC storage lesions. By using one- and two-dimensional western blotting, both the results of the 2D DIGE experiment and the selected marker proteins were validated. In order to investigate the alterations of the cytosolic RBC proteome due to gamma irradiation and subsequent ex vivo storage, a second 2D DIGE experiment was conducted using 12 RBC concentrates that were irradiated with 30 Gy to inactivate remaining T-lymphocytes and stored for 1 or 15 days at 4 ± 2°C. Gamma irradiation according to the European CE guidelines was found to enhance conventional RBC storage lesions. A total of 27 spots were significantly altered after 15 days of post-irradiation storage, and out of 13 identified proteins, DNA damage-binding protein 1, valosin-containing protein and transglutaminase 2 were selected and validated as potential biomarkers for irradiation- and storage-induced RBC lesions. The protein patterns and marker proteins identified within this thesis contribute to the understanding of the structural and functional changes occurring in the course of red cell concentrate preparation and ex vivo storage. Both in transfusion medicine and preventive doping research, they could be used to monitor the quality of stored RBCs or develop a screening assay for the detection of autologous blood doping in elite sports.